Université Lille 2 Droit et Santé

Dimanche 20 septembre 2020
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Discipline(s) d'activité

Maladies Infectieuses

Principaux axes de recherche

Virulence de Pseudomonas aeruginosa et mécanismes de réponse de l’hôte

 

Axes de recherche

  1. Rôle des kynurénines bactériennes dans la virulence de P. aeruginosa
  2. Interaction de PscI avec la voie de l’inflammasome
  3. Rôle du Microbiote digestif et pulmonaire dans l’infection à P. aeruginosa

Mots-clés

Pseudomonas aeruginosa, facteurs de virulence, PscI, Nod Like Receptors, Toll Like Receptors, kynurénine, système de sécrétion de type III, microbiote, immunité muqueuse

Keywords

Pseudomonas aeruginosa, virulence factors, PscI, Nod Like Receptors, Toll Like Receptors, kynurenin, Type III secretion system, microbiota, mucosal immunity

Résumé du programme pour la période 2010-2013

 

 

Résumé du programme pour la période 2014-2017

Pseudomonas aeruginosa est un bacille Ă  Gram nĂ©gatif ubiquitaire de l’environnement. Il possède un mĂ©tabolisme respiratoire exclusivement oxydatif, utilisant l’O2 et parfois les nitrates comme accepteurs d’électrons en croissance anaĂ©robie. P. aeruginosa est retrouvĂ© dans l’eau, le sol mais Ă©galement dans les biofilms (Schwarzer C et al, 2012). En pathologie humaine, P. aeruginosa est un pathogène opportuniste, responsable d’infections aiguĂ«s et chroniques chez les sujets prĂ©sentant un dĂ©ficit de l’immunitĂ© innĂ©e pulmonaire (telle que la mucoviscidose) (Bajmoczi M et al, 2009) mais aussi d’infections respiratoires aiguĂ«s chez les sujets admis dans les unitĂ©s de rĂ©animation (Hauser AR, 2012).  En effet, les pneumopathies acquises sous ventilation mĂ©canique (PAVM) Ă  P. aeruginosa reprĂ©sentent la première cause de pneumonie en rĂ©animation et sont associĂ©es Ă  une mortalitĂ© importante, cet agent infectieux Ă©tant associĂ© au pronostic le plus pĂ©joratif (Chastre et al, 2002).

 

1)    RĂ´le des kynurĂ©nines bactĂ©riennes dans l’interaction hĂ´te-P. aeruginosa

Le système des kynurénines est la voie majeure de dégradation oxydative du tryptophane puisque chez l’Homme, 99% du tryptophane alimentaire est dégradé en kynurénines (Murakami Y et al, 2013). Étudié chez les eucaryotes depuis plus d’un siècle, ce métabolisme est de découverte récente par des études de génétique comparative chez quelques rares procaryotes dont P. aeruginosa (Kurnasov OO et al, 2003). L’existence de cette voie chez l’homme comme chez le pathogène en fait un support possible d’interactions hôte-pathogènes et certaines études suggèrent que les kynurénines seraient impliquées dans la virulence de P. aeruginosa (Shen DK et al, 2008) constituant possiblement une cible thérapeutique.

Chez l’homme, la première Ă©tape de cette voie est rĂ©alisĂ©e par deux enzymes, la tryptophane 2,3 di-oxygĂ©nase (TDO), constitutive, prĂ©sente dans le foie, et l’indoleamine 2,3 di-oxygĂ©nase (IDO), inductible au cours de l’inflammation, prĂ©sente dans de nombreuses cellules (Ă©pithĂ©liales, endothĂ©liales, myĂ©loĂŻdes etc). Le tryptophane est alors dĂ©gradĂ© par une cascade enzymatique en plusieurs mĂ©tabolites constituant le groupe des kynurĂ©nines (Phillips RS et al, 2011). L’étude de ces molĂ©cules, dont l’intĂ©rĂŞt portait initialement sur leur rĂ´le tolĂ©rogène dans la carcinogĂ©nèse, a permis de dĂ©couvrir chez elles de nombreuses autres fonctions biologiques (Schwartz et al, 2004). Produites en rĂ©ponse Ă  une inflammation, elles exercent un rĂ´le de rĂ©gulation visant Ă  maintenir l’homĂ©ostasie, et rĂ©orientent la rĂ©ponse cytokinique vers un profil anti-inflammatoire (Mándi Y et al, 2012). Elles possèdent par ailleurs des propriĂ©tĂ©s immunomodulatrices aboutissant Ă  un Ă©tat d’immunotolĂ©rance dont la voie d’action principale passerait par l’activation du rĂ©cepteur Ă  l’Aryl-hydrocarbone (AhR) (Optiz CA et al, 2011). En effet, des Ă©tudes rĂ©centes ont montrĂ© que les kynurĂ©nines, ainsi que d’autres catabolites du tryptophane nommĂ©s phĂ©nazines, s’avèrent ĂŞtre des ligands de ce rĂ©cepteur cytoplasmique ayant un rĂ´le de facteur de transcription dans de nombreuses cellules du système immunitaire (Moura-Alves P et al, 2014). Les kynurĂ©nines induisent l’anergie ou l’apoptose des cellules de la voie Th-1, et inhibent la prolifĂ©ration des cellules T effectrices (CD8, NKTαβ), des cellules NK, et des lymphocytes B. En revanche, elles favorisent la diffĂ©renciation des lymphocytes TCD4+ en cellules T rĂ©gulatrices (Pucchio TD et al, 2010 ; Munn DH et al, 2013). Produites Ă©galement par les cellules de l’immunitĂ© innĂ©e comme les macrophages, les polynuclĂ©aires neutrophiles (PNN) et les cellules Ă©pithĂ©liales, les fonctions des kynurĂ©nines sont, dans ce contexte, moins bien connues. A l’instar des cellules T effectrices, Morita et al rapportent un rĂ´le similaire des kynurĂ©nines induisant l’apoptose des cellules monocytaires (Morita T et al, 2001). Le rĂ´le des kynurĂ©nines de l’hĂ´te sur les pathogènes est mal Ă©tabli et varie en fonction du pathogène en cause et du caractère aigu ou chronique de l’infection (Jung et al, 2009 ; Murakami Y et al, 2013). Des effets antimicrobiens, antiviraux, antifungiques et antiparasitaires dĂ©pendants de l’activation de l’IDO ont Ă©tĂ© observĂ©s et sont principalement attribuĂ©s Ă  la dĂ©plĂ©tion du milieu environnant en tryptophane. Cependant, plusieurs Ă©tudes suggèrent que l’activation de cette voie se ferait au profit du pathogène par l’induction d’une immunotolĂ©rance avec une diminution du recrutement et de l’activation des cellules effectrices de l’immunitĂ© innĂ©e et adaptative (Pucchio TD et al, 2010 ; Munn DH et al, 2013).

 

Figure 1: Voie de synthèse des kynurénines chez l’homme

Chez P. aeruginosa, la première enzyme de la voie de synthèse est la Tryptophane 2,3 di-oxygenase, codĂ©e par le gène kynA, qui convertit le tryptophane en N-formylkynurĂ©nine (Knoten CA et al, 2011). La dernière enzyme de cette voie de synthèse est la KynurĂ©ninase, codĂ©e par le gène kynU, dont le rĂ´le est de convertir la kynurĂ©nine en anthranilate. P. aeruginosa possède par ailleurs un rĂ©gulateur transcriptionnel nommĂ© KynR, responsable d’un rĂ©trocontrĂ´le positif du gène kynA en prĂ©sence de kynurĂ©nines. Il serait donc capable de « dĂ©tecter » les kynurĂ©nines, y compris les kynurĂ©nines de l’hĂ´te dans son environnement. . Les enzymes bactĂ©riennes et humaines partageant les mĂŞmes substrats (Phillips et al, 2011), le système des kynurĂ©nines bactĂ©riennes pourrait de ce fait constituer un facteur de virulence potentiel, capable d’orienter la rĂ©ponse immunitaire de l’hĂ´te Ă  son profit.  RĂ©cemment, il a Ă©tĂ© montrĂ© que la survie de P. aeruginosa mis en prĂ©sence de polynuclĂ©aires neutrophiles (PNN) Ă©tait augmentĂ©e dans un milieu Ă  forte concentration en kynurĂ©nines. Ce rĂ©sultat est expliquĂ© par une diminution significative des capacitĂ©s de bactĂ©ricidie des PNN par les kynurĂ©nines qui jouent un rĂ´le de scavenger des espèces rĂ©actives de l’oxygène produites par les phagocytes (Genestet et al, 2014).


Figure 2: Voie de synthèse des kynurénines chez la bactérie

L’objectif de notre projet est donc de préciser le rôle des kynurénines de P. aeruginosa dans un modèle murin d’agression respiratoire aiguë.

 

2)    PscI et activation de l’inflammasome

Le SST3, retrouvĂ© chez de nombreux BGN, est une structure supramolĂ©culaire formĂ©e de l’assemblage de plusieurs protĂ©ines. Il se prĂ©sente comme une «seringue» composĂ©e de 3 Ă©lĂ©ments: une base transmembranaire avec un «cĹ“ur», une partie extra-membranaire Â«l’aiguille» et un appareil de translocation capable de permĂ©abiliser les cellules de l’hĂ´te (Hauser et al, 2009). Parmi les protĂ©ines du SST3, on retrouve PscI au niveau du cĹ“ur transmembranaire, PscF qui constitue l’aiguille et PopB et PopD au niveau de l’appareil de translocation (c.f. Figure). Via le SST3, P. aeruginosa «injecte» des exotoxines (Exo S, T, U, Y) dans les cellules mais aussi des protĂ©ines constitutives du SST3 (Lefevre et al, 2014). Le SST3 est le seul facteur de virulence de P. aeruginosa pour lequel il a Ă©tĂ© montrĂ© une surmortalitĂ© Ă  la fois dans des modèles animaux ( Hauser et al, 2009) et dans des Ă©tudes cliniques (Hauser et al, 2012; Roy Burman et al, 2001).


Système de sĂ©crĂ©tion de type III : base avec cĹ“ur protĂ©inique (PscI); aiguille (PscF) et appareil de translocation (PcrV, PopB et PopD). SĂ©crĂ©tion par le STT3 d’exotoxines (Exo S, T, U, Y).

 

En dehors de l’injection d’exotoxines, le SST3 semble avoir d’autres rĂ´les et est notamment impliquĂ© dans la rĂ©ponse immunitaire innĂ©e de l’hĂ´te.  Il a Ă©tĂ© montrĂ© que le STT3, par le biais des protĂ©ines constitutives transloquĂ©es dans le cytosol des cellules hĂ´tes, active des rĂ©cepteurs intracellulaires de l’immunitĂ© innĂ©e, les Nod-like receptors (NLR). Les NLR reconnaissent des motifs molĂ©culaires associĂ©s au pathogène (PAMPs : pathogen associated molecular pattern) ou au danger (DAMPs : danger associated molecular pattern) (Mariathasan et al, 2007).

Après activation, les NLR s’assemblent au sein d’un complexe multi-protĂ©ique intracellulaire, l’inflammasome. Ce complexe active la caspase 1 en catalysant l’auto-protĂ©olyse de la procaspase 1 en caspase 1 mature (Mariathasan et al, 2007). La caspase 1 mature  joue un rĂ´le majeur dans l’initiation de la rĂ©ponse immune. Elle entraine la production de cytokines pro-inflammatoires matures, IL1β et IL18 (interleukines 1β et 18), en clivant les formes pro-IL1β et pro-IL18 provenant de l’activation du facteur de transcription  nuclear factor-kappa B (NFÎşB) et induit une mort cellulaire inflammatoire: la pyroptose (Lamkanfi et al, 2011).

Des modèles in-vitro sur des macrophages murins ont montré que les protéines du cœur et de l’aiguille du STT3 de plusieurs BGN, dont P. aeruginosa, sont reconnues par des NLR murins (Miao et al, 2010; Yang et al, 2013 ; Zhao et al, 2011). Cette reconnaissance entraine notamment la production d’IL1β par les macrophages par activation du complexe NLR-inflammasome. Des modèles in vitro sur des cellules humaines de l’immunité innée ont montré que les protéines de l’aiguille de STT3 sont aussi reconnues par les NLR humains, y compris pour P. aeruginosa (Yang et al, 2013). A l’inverse, une seule étude s’est intéressée aux protéines du cœur; ses résultats suggèrent que PrgJ de Salmonella typhi n’est pas reconnue chez l’homme (Rayamajhi et al, 2013). Aucune donnée n’existe avec P. aeruginosa.

L’équipe du laboratoire iRTSV/CEA (Grenoble) a Ă©tudiĂ© la protĂ©ine du cĹ“ur du SST3 de P. aeruginosa, PscI, en synthĂ©tisant une protĂ©ine recombinante. La structure de cette protĂ©ine, repliĂ©e en 4 hĂ©lices α a Ă©tĂ© prĂ©dite Ă  partir d’un modèle bioinformatique. La fonctionnalitĂ© de la protĂ©ine a Ă©tĂ© testĂ©e sur un modèle murin in vitro et il a Ă©tĂ© montrĂ© que PscI active la sĂ©crĂ©tion d’IL1β dans des macrophages murins pĂ©ritonĂ©aux (Monlezun et al, 2015). Notre laboratoire a reproduit ces rĂ©sultats, qui sont en faveur d’une reconnaissance de PscI par le complexe NLRC4-inflammasome chez la souris. PscI n’a pas encore Ă©tĂ© testĂ© chez l’homme.

L’objectif de notre projet est de montrer que PscI, protéine du cœur de la base du SST3 de P. aeruginosa, active le complexe NLRC4-inflammasome dans des cellules humaines et joue un rôle dans la virulence de la bactérie.

 

3)    Microbiote digestif et pulmonaire dans l’infection Ă  P. aeruginosa

Le microbiote intestinal porte des fonctions physiologiques importantes pour l’homme. Il participe à l’absorbtion des nutriments, à la régulation du stockage des graisses, à promouvoir le renouvellement de l’épithélium intestinal et à la maturation du système immunitaire. Le microbiote est également un régulateur important du système immunitaire dans sa maturation et dans son efficience à éliminer d’éventuels intrus.

               Le microbiote intestinal par les ligands qu’ils synthĂ©tise comme  le lipopolysaccharide (LPS), le muramyldipeptide (MDP) ou la flagelline est connu pour solliciter, via des rĂ©cepteurs de l’immunitĂ© innĂ©e, des cellules immunes prĂ©sentes dans la muqueuse. Cette interaction entre microbiote et systèmes immunitaires innĂ©es via ces rĂ©cepteurs promeut la maturation et la diffĂ©rentiation de diffĂ©rentes populations lymphocytaires comme les lymphocytes T CD8+ ou CD4+, les lymphocytes T rĂ©gulateurs ou les lymphocytes Th17 via l’action de cytokines et chimiokines. Il existe un Ă©quilibre dans la rĂ©ponse apportĂ©e par ces diffĂ©rents types de population lymphocytaire afin de prĂ©server l’intĂ©gritĂ© de la muqueuse.

Plusieurs études ont montré qu’une perturbation du microbiote digestif peut augmenter la susceptibilité de l’hôte à différentes infections intestinales ou extra-intestinales. Chacune des composantes du microbiote semble avoir un rôle spécifique sur la régulation de la réponse inflammatoire et antimicrobienne de la muqueuse intestinale. Des études réalisées sur des bactéries filamenteuses segmentées ont montrées qu’elles étaient associées à un profil inflammatoire Th17 lors de colonisation de souris gnotobiotique. A l’inverse, d’autres bactéries, tel que Faecalibacterium prausnitzii, semblent présenter une action immunorégulatrice en inhibant les voies pro-inflammatoires. Un traitement antibiotique par voie orale peut ainsi induire une perturbation dans la composition du microbiote, dans sa qualité et sa quantité, aboutissant à un défaut de maturation des cellules immunitaire, de production de peptides antimicrobiens et un déséquilibre de la balance Th17/Treg.

L’objectif de notre projet est d’évaluer l’impact de la perturbation du microbiote digestif par des traitements antibiotiques sur la réponse à une infection pulmonaire aiguë à Pseudomonas aeruginosa dans un modèle murin. Dans un second temps, nous focaliserons nos recherches sur les interactions qui peuvent exister entre microbiote intestinal et microbiote pulmonaire.

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